E' stato commesso un crimine, e gli investigatori hanno raccolto un mozzicone di sigaretta gettato dal criminale vicino al luogo del delitto. Ci sono tre sospetti senza ulteriori prove contro uno particolare dei tre, ma attraverso il DNA trovato sul mozzicone di sigaretta, la polizia scientifica riesce a scagionare due dei sospetti, individuando il colpevole.
Come è possibile questo? Da qualche decennio, il DNA fingerprinting permette di confrontare tra loro, in modo relativamente semplice, diversi DNA.
Questa esperienza ripropone in classe questa tecnica, usando un kit EDVOTEK, al quale si rimanda per la descrizione dettagliata del procedimento.
Teoria
Il DNA fingerprinting è una tecnica per distinguere diversi DNA, utilizzata in vari campi come le scienze forensi, la ricerca della paternità etc...
Viene sfruttata la
presenza, nel DNA, di alcune sequenze ripetute (STR, Short Tandem
Repeats, o VNTR, Variable Number Tandem Repeats), la cui lunghezza
varia da individuo a individuo.
Il campione di DNA raccolto
viene amplificato selettivamente tramite PCR (Polymerase Chain
Reaction): una miscela contenente il DNA campione, dei primer (brevi
sequenze di DNA, opportunamente scelti perché si leghino agli
estremi di alcuni STR o VNTR), dei singoli nucleotidi e la polimerasi
estratta da batteri termoresistenti viene scaldata prima a 94° C,
causando la denaturazione del DNA (ma non della polimerasi
termoresistente), poi raffreddata a 45° C, permettendo ai primer di
legarsi al DNA campione, e infine riscaldata a 72° C, temperatura
alla quale la polimerasi sintetizza una nuova sequenza di DNA tra i
primer. Si produce così, su ogni filamento di DNA originale, un
filamento “copia”, frammentato in corrispondenza dei primer.
Siccome i primer si legano alle estremità degli STR o VNTR, di
lunghezza diversa da individuo a individuo, anche i frammenti
prodotti avranno lunghezze caratteristiche per ogni individuo. Questo
ciclo di temperature viene ripetuto decine di volte, in modo da
amplificare il DNA (riprodurlo esponenzialmente).
La miscela di frammenti
ottenuta dalla PCR deve essere separata per poter distinguere i
frammenti di diversa lunghezza: poiché il DNA è una molecola che
presenta cariche negative, questo può essere effettuato tramite
elettroforesi. Immerso in un campo elettrico, il DNA migrerà verso
il polo positivo, e nel tragitto, se il mezzo è sufficientemente
viscoso (come ad esempio un gel), le molecole più piccole (che
offrono meno resistenza) migreranno più rapidamente delle molecole
più grandi.
E' necessario, poi,
rendere visibili i frammenti di diversa lunghezza, e questo è
possibile utilizzando un colorante (blu di metilene) che abbia
affinità con il DNA: applicando il colorante, questo colorerà
l'intero gel, ma lavandolo via con acqua, rimarrà solo in
corrispondenza dei frammenti di DNA.
Lo scopo di questa esperienza è dimostrare che è
possibile distinguere DNA diversi tramite elettroforesi su gel,
simulando il confronto del DNA raccolto su una scena del crimine con
il DNA di tre sospetti.
Materiale:
- Campioni di DNA da analizzare, già sottoposti a PCR:
- DNA standard, contenente frammenti di lunghezza nota
- DNA da confrontare (ipoteticamente raccolto sulla scena del crimine)
- DNA del sospetto 1
- DNA del sospetto 2
- DNA del sospetto 3
- Gel di agarosio nello stampo
- Soluzione tampone (300 mL)
Strumenti:
- Camera di elettroforesi con coperchio e alimentatore
- Micropipetta da 20 - 200 uL e relativi puntali
- Vaschetta in grado di contenere la lastrina di gel
- Cilindro graduato
Procedimento:
Vedi l'elettroforesi su gel.
Risultato:
Sulla lastrina, dopo la decolorazione,
dovrebbero essere visibili diverse bande:
- Il campione A ha numerose bande
- Il campione B dovrebbe avere due bande ravvicinate
- Il campione C dovrebbe avere solo una delle due bande del
campione B
- Il campione D dovrebbe avere le stesse bande del B
- Il campione E dovrebbe avere due bande diverse rispetto al campione B
Bibliografia:
- EDVOTEK Inc., 2009, PCR Amplification of DNA for fingerprinting.
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