Fermentazione alcolica dei lieviti

La fermentazione è un processo metabolico che avviene in assenza di ossigeno. Nel corso delle reazioni, il glucosio viene trasformato in altri composti organici, producendo energia.

I lieviti sono organismi eterotrofi anaerobi facoltativi: in assenza di ossigeno, ottengono energia per la loro sopravvivenza dalla fermentazione dello zucchero glucosio che viene trasformato in alcol etilico e diossido di carbonio.

Durata: 1 ora

Scopo:

Dimostrare che durante la fermentazione del lievito di birra vengono prodotti anidride carbonica ed etanolo (alcol etilico). 

Teoria:

Gli acini di uva, a osservarli bene, sono ricoperti spesso da una patina biancastra. Essa contiene una certa quantità di lieviti, appartenenti alla divisione Ascomycota.

Come detto, i lieviti sono in grado di attuare sia un metabolismo aerobico che anaerobico: per tale motivo vengono anche definiti anaerobi facoltativi.

Tutti i lieviti, in presenza di ossigeno, iniziano velocemente a moltiplicarsi, producendo anidride carbonica come sottoprodotto. Quando l’ossigeno incomincia a scarseggiare, inizia la respirazione anaerobica, in cui scindono gli zuccheri semplici producendo anidride carbonica e alcool etilico.

In assenza di ossigeno, quindi, i lieviti sono in grado di trasformare il piruvato in etanolo secondo due reazioni consecutive: la prima consiste nella decarbossilazione del piruvato mentre la seconda tappa è la riduzione dell’acetaldeide in etanolo.

La reazione che siamo abituati a vedere è la seguente :

C6H12O6 ⇒ 2 CH3CH2OH + 2 CO2

glucosio ⇒ etanolo + anidride carbonica

Materiale:

• soluzione di acqua e zucchero con lievito
• blu di bromotimolo
• soluzione NaOH 10%
• reattivo di Lugol

Strumenti:

• aste di sostegno con pinza
• provette
• pipette
• tappo di gomma forato
• tubo di gomma

Procedimento:

Produzione di anidride carbonica da fermentazione:

1. Fissare in posizione verticale sulle aste di sostegno due provette mediante le pinze metalliche
2. In una provetta mettere la soluzione di acqua e zucchero con lievito 
3. Nell’altra provetta mettere la soluzione di blu di bromotimolo
4. Mettere il tappo di gomma a chiudere la provetta contenente la soluzione con il lievito
5. Collegare il tubo al tappo di gomma e immergere l’altra estremità nella soluzione di blu di bromotimolo (per velocizzare la fermentazione mettere la provetta in bagno termostato a 40-50°C
6. Eseguire lo stesso procedimento con una soluzione di acqua e lievito senza zucchero per verificare l'esperienza

Produzione di etanolo da fermentazione:

1. Con una pipetta trasferire circa 5 mL di soluzione contenente il lievito in una provetta
2. Aggiungere 2 mL di NaOH al 10% e mescolare delicatamente
3. Aggiungere circa 3 mL goccia a goccia di reattivo di Lugol e mescolare

Risultato:

Dopo qualche minuto dalla provetta contenente il lievito si vedranno salire alcune bollicine di gas che, passando attraverso il tubo di sviluppo, raggiungeranno la soluzione di blu di bromotimolo.

Dopo circa 5 minuti, sul fondo della provetta si forma un precipitato giallo,  lo iodoformio, un composto prodotto dalla reazione fra l’alcol etilico e lo iodio del reattivo di Lugol.

Commenti:

Bibliografia:

Husak_prima_Quaderno di laboratorio.pdf

https://lezioniignoranti.altervista.org/fermentazione-alcolica-esperimento/

Terreni e crescita dei lieviti

Ogni essere vivente ha bisogno di un ambiente con determinate caratteristiche per crescere: la giusta umidità, la giusta temperatura, il pH corretto, qualcosa di cui nutrirsi se è eterotrofo, l'ossigeno se è aerobio... In questa esperienza studieremo quali caratteristiche deve avere un terreno per permettere la crescita di lieviti.

Lieviti dell'uva

Durata: 

1 h preparazione del terreno, 1 ora sterilizzazione, ½ ora semina, 3 giorni incubazione, 15' osservazione (+ tempo per eventuali vetrini)

Scopo:

Isolare e osservare i lieviti presenti sulla buccia dell'uva.

Materiale:

• Uva
  
• Per il terreno (15 mL per piastra):
  
  • Estratto di lievito 10 g
    
  • Glucosio 20 g
    
  • Peptone 20 g
    
  • Agar 15 g
    
  • Acqua distillata 1000 mL
    

Strumenti:

• Per il terreno:
  

• Flacone con tappo a vite
  
• Cilindro graduato
  
• Bacchetta di vetro
  
• Vetrini da orologio
  
• Spatole
  
• Piastra riscaldante
  
• Bilancia tecnica
  
• Autoclave
  
• Contenitore autoclavabile
  
• Pestello
  
• Piastre Petri
  
• Ansa
  
• Becco Bunsen
  
• Cappa a flusso laminare
  
• Termostato
  

Procedimento:

1. Preparazione del terreno
   
   1. Pesare l'estratto di lievito, il glucosio, il peptone e l'agar e metterli nel flacone con tappo a vite
      
   2. Aggiungere l'acqua distillata
      
   3. Portare a ebollizione su piastra riscaldante, mescolando
      
   4. Sterilizzare in autoclave a 121° C per 15', tenento il tappo non completamente chiuso, insieme ad un contenitore e un pestello
      
2. Preparazione delle piastre (lavorare sterilmente vicino a un Bunsen o sotto cappa a flusso laminare)
   
   1. Preparare le piastre col coperchio verso l'alto vicino al Bunsen, e il flacone di terreno ancora liquido ma che non scotti.
      
   2. Tenere il flacone con la mano destra, aprire il tappo (che va tenuto in mano, a seconda di come uno è più comodo tra il pollice e l'indice della mano destra o sinistra) e flambare l'imboccatura del flacone.
      
   3. Aprire parzialmente la prima piastra, versarvi il terreno fino a coprirne ¾ circa, richiudere la piastra.
      
   4. Stendere uniformemente il terreno nella piastra muovendola a 8 sul piano di lavoro.
      
   5. Lasciarla raffreddare col coperchio semiaperto vicino al Bunsen (o sotto cappa a flusso laminare)
      
   6. Ripetere i punti da 3 a 5 per tutte le piastre.
      
   7. Una volta che si sono raffreddate e non presentano più condensa, richiudere i coperchi.
      
3. Semina (lavorare sterilmente vicino a un Bunsen o sotto cappa a flusso laminare)
   
   1. Pestare l'uva nel contenitore sterile con il pestello
      
   2. Preparare le piastre col terreno capovolte
      
   3. Sterilizzare l'ansa nella fiamma, attendere 15' che si raffreddi
      
   4. Prelevare con l'ansa una piccola porzione del mosto pestato
      
   5. Sollevare con la mano sinistra il fondo di una piastra.
      
   6. Strisciare l'ansa sul terreno, senza scavarlo.
      
   7. Richiudere la piastra.
      
   8. Ripetere i punti da 2 a 6 per tutte le piastre, infine sterilizzare l'ansa nella fiamma.
      
   9. Scrivere sul bordo del coperchio delle piastre il cognome, la classe, il contenuto (striscio da uva), il terreno e la data di semina.
      
4. Incubare a 25° per 3 giorni
   
5. Osservare a occhio nudo, allo stereomicroscopio o al microscopio preparando vetrini.
   
6. Sterilizzare le piastre usate in autoclave a 121 °C per 15', usando un sacchetto da autoclave.
   

Risultato:

Dovrebbero crescere colonie emisferiche, bianche, lucide e cremose di lievito. Un lievito comune è Hanseniaspora uvarum (= Kloechera apiculata), con le cellule a forma di “limone”, cioè con due apici agli estremi della cellula.

Hanseniaspora uvarum isolata dall'uva (obiettivo 40x, oculare 10x)