Terreni e crescita dei lieviti

Ogni essere vivente ha bisogno di un ambiente con determinate caratteristiche per crescere: la giusta umidità, la giusta temperatura, il pH corretto, qualcosa di cui nutrirsi se è eterotrofo, l'ossigeno se è aerobio... In questa esperienza studieremo quali caratteristiche deve avere un terreno per permettere la crescita di lieviti.

Durata:

2 ore preparazione terreni, 1:30 sterilizzazione, 1 ora semina, 3 giorni incubazione, 15' osservazione dei risultati.

Scopo:

Determinare le caratteristiche di un terreno necessarie alla crescita del lievito di birra Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C., 1883.

Teoria:

Ogni organismo, per poter vivere, ha bisogno di occupare la sua nicchia ecologica, cioè le caratteristiche dell'ambiente in cui vive devono rientrare in un intervallo di valori tollerati dall'organismo.

Le caratteristiche che verranno prese in considerazione in questo esperimento sono:

• pH: soprattutto per i microrganismi, il pH è un fattore che ne condiziona particolarmente la crescita. Soluzioni molto acide o molto basiche possono denaturare le proteine o modificare l'equilibrio ionico della cella, provocandone la morte o ostacolando la sua crescita.
• Concentrazione salina: per osmosi, una cellula immersa in una soluzione a concentrazione salina troppo elevata perderà acqua, raggrinzendosi; viceversa in una soluzione troppo diluita assorbirà acqua, gonfiandosi, col rischio di esplodere.
• Fonte di carbonio ed energia: gli organismi eterotrofi necessitano, per vivere, di una fonte di energia che sia anche fonte di carbonio, cioè di composti organici. Quelli di solito sfruttati sono carboidrati, proteine o lipidi.
• Fonte di azoto, fosforo e micronutrienti: avere a disposizione una fonte di carbonio ed energia non è sufficiente per la crescita, per produrre le biomolecole necessarie ad accrescersi e generare nuovi organismi sono necessari anche azoto, fosforo e micronutrienti, generalmente forniti da proteine e sali. 

Materiale:

• Acqua distillata
• Glucosio
• Peptone
• Estratto di lievito
• Cloruro di sodio
• Acido cloridrico concentrato
• Idrossido di sodio 10%
• Lievito di birra
• Altri componenti per terreni da microbiologia
• Cartina indicatrice universale

Strumenti:

• Provette da microbiologia con tappo e portaprovette
• Becher
• Vetrini da orologio
• Bacchette di vetro
• Cilindri graduati
• Pipette Pasteur
• Ansa
• Spatole
• Bilancia tecnica
• Autoclave
• Becco Bunsen
• Cappa a flusso laminare
• Incubatrice

Procedimento:

1. Preparazione dei terreni
   1. Preparare ed etichettare (con matita su nastro adesivo di carta) 10 provette in questo modo:
      1. Provetta 1:
         Glucosio 20 g/L
         Peptone 20 g/L
         Estratto di lievito 10 g/L
         Acqua distillata 15 mL
      2. Provetta 2: come la 1
      3. Provetta 3: acqua distillata 15 mL
      4. Provetta 4:
         Glucosio 20 g/L
         Acqua distillata 15 mL
      5. Provetta 5:
         Peptone 20 g/L
         Acqua distillata 15 mL
      6. Provetta 6:
         Estratto di lievito 10 g/L
         Acqua distillata 15 mL
      7. Provetta 7: come la 1 + acido cloridrico q.b. a pH 0
      8. Provetta 8: come la 1 + idrossido di sodio q.b. a pH 14
      9. Provetta 9: come la 1 + cloruro di sodio fino a saturazione
      10. Provetta 10: a scelta degli studenti
2. Semina (lavorare sotto cappa a flusso laminare, tranne che le operazioni sul becco Bunsen che va tenuto vicino alla cappa)
   1. Sterilizzare l'ansa sulla fiamma, lasciare raffreddare sotto cappa per almeno 15''.
   2. Prelevare una piccolissima quantità di lievito.
   3. Aprire la provetta 2 e flambare l'imboccatura di tappo e provetta.
   4. Stemperare l'ansa dentro il terreno contenuto nella provetta.
   5. Flambare e richiudere la provetta.
   6. Ripetere i punti da 1 a 5 con le provette da 3 a 10 (la 1 sarà il controllo terreno e non va seminata).
   7. Alla fine, sterilizzare l'ansa sulla fiamma.
3. Incubare a 27° C per 3 giorni
4. Osservare in quali provette c'è stata crescita di lieviti

Risultato:

In alcune provette i lieviti dovrebbero essersi riprodotti, formando un sedimento chiaro e, se hanno fermentato gli zuccheri, dovrebbe essersi formata un po' di effervescenza dovuta all'anidride carbonica prodotta.

In particolare, i lieviti dovrebbero essere cresciuti nella provetta 2, che conteneva un terreno idoneo alla loro crescita (pH e salinità ideali, presenza di glucosio come fonte di carbonio ed energia, presenza di peptone ed estratto di lievito come fonte di azoto, fosforo e micronutrienti).

Anche nelle provette 5 e 6 dovrebbero essere cresciuti i lieviti, perché pur mancando grandi quantità di carboidrati, nel peptone e nell'estratto di lievito sono presenti sia una fonte di carbonio ed energia sia i nutrienti essenziali.

Nella provetta 3 non dovrebbe esserci crescita, perché manca qualsiasi nutriente o fonte di energia e la soluzione è ipotonica (troppo poco concentrata).

Nella provetta 4 non dovrebbe esserci crescita, perché pur essendo presente il glucosio mancano i nutrienti fondamentali (soprattutto l'azoto).

Nelle provette 7, 8 e 9 non dovrebbe esserci crescita (un eventuale sedimento diverso dai lieviti potrebbe essere dovuto alla coagulazione delle proteine) perché le condizioni di pH e salinità sono al di fuori di quelle tollerate dai lieviti.

La crescita nella provetta 10 dipende dal terreno scelto, mentre la provetta 1 (controllo terreno) dovrebbe rimanere sterile.