Latte crudo, latte sano?

Qualche anno fa, dopo una rapida diffusione dei distributori di latte crudo, si discusse ampiamente sulla sicurezza microbiologica del latte crudo, accusato di poter contenere microrganismi patogeni in quantità pericolosa per l'uomo, in particolare per le persone più vulnerabili come, ad esempio, i bambini piccoli. Il latte pastorizzato, invece, subisce un trattamento termico che dovrebbe eliminare la maggior parte dei microrganismi del latte, in particolare quelli patogeni. In questa esperienza verificheremo se il latte pastorizzato contiene effettivamente meno microrganismi del latte crudo.

Durata: 

1 h preparazione terreni, 1.30 h sterilizzazione, 2 h semina, 3 giorni incubazione, 1 h lettura risultati.

Scopo:

Verificare se il latte pastorizzato contiene meno microrganismi del latte crudo.

Teoria:

Nel latte bovino crudo sono normalmente presenti microrganismi: da quelli presenti già all'interno della mammella, a quelli che entrano in contatto col latte all'esterno della mammella o nell'impianto di mungitura e di conservazione del latte. Alcuni di questi microrganismi possono essere pericolosi per l'uomo: per questo di solito il latte viene pastorizzato, cioè scaldato a 75 - 85 °C per circa 15 secondi. Questo trattamento dovrebbe eliminare la maggior parte dei microrganismi, soprattutto quelli patogeni.
Per legge, il latte crudo deve comunque presentare una carica batterica inferiore a 100000 CFU/mL.

Materiale:

• Latte bovino crudo
• Latte bovino pastorizzato
• Terreno di coltura Plate Count Agar
• Piastre Petri sterili
• Soluzione fisiologica (o altra soluzione per diluizioni)
• Acqua distillata

Strumenti:

• Flaconi con tappo a vite
• Provette da microbiologia con tappo
• Pipetta graduata da 10 mL con propipetta
• Pipette sterili da 1 mL
• Cilindro graduato
• Becher
• Bacchetta di vetro
• Spatola
• Bilancia tecnica
• Piastra riscaldante
• Autoclave
• Bagno termostatico
• Cappa a flusso laminare
• Becco Bunsen

Procedimento:

1. Preparazione delle provette per diluizione
   1. Versare, con una pipetta tarata, 9 mL di soluzione fisiologica in ciascuna di quattro provette.
   2. Chiudere le provette con il tappo e contrassegnarle scrivendo a matita su un pezzetto di nastro adesivo di carta (l'inchiostro indelebile sul vetro verrebbe cancellato in autoclave). Numerarle da 1 a 4.
   3. Sterilizzare a 121 °C per 15'.
2. Preparazione dei terreni
   1. Calcolare il volume di terreno da preparare, considerando che ne servono almeno 15 mL per piastra. Calcolare di conseguenza la quantità di terreno in polvere da pesare, secondo le indicazioni della confezione.
   2. Pesare nel becher la quantità calcolata di terreno.
   3. Misurare col cilindro un volume di acqua distillata uguale al volume di terreno calcolato, e versarlo nel becher.
   4. Sciogliere il terreno scaldando il becher sulla piastra, mantenendo agitata la soluzione, fin quasi all'ebollizione.
   5. Versare il terreno ancora caldo nel flacone con tappo a vite.
   6. Etichettare il flacone scrivendo a matita su un pezzetto di nastro adesivo di carta.
   7. Chiudere il tappo non completamente, in modo che l'aria sia libera di entrare e uscire.
   8. Sterilizzare a 121 °C per 15'.
   9. Conservare il terreno col tappo ben chiuso a bagnomaria a 50 °C.
3. Semina (lavorare sotto cappa a flusso laminare)
   1. Etichettare le piastre con nome, classe, data, contenuto. Il contenuto delle piastre sarà:
      1. Controllo terreno
      2. Latte crudo 10^-2 piastra 1
      3. Latte crudo 10^-2 piastra 2
      4. Latte crudo 10^-3 piastra 1
      5. Latte crudo 10^-3 piastra 2
      6. Latte crudo 10^-4 piastra 1
      7. Latte crudo 10^-4 piastra 2
      8. Latte pastorizzato 10^-2 piastra 1
      9. Latte pastorizzato 10^-2 piastra 2
      10. Latte pastorizzato 10^-3 piastra 1
      11. Latte pastorizzato 10^-3 piastra 2
      12. Latte pastorizzato 10^-4 piastra 1
      13. Latte pastorizzato 10^-4 piastra 2
   2. Con una pipetta sterile, prelevare 1 mL di latte crudo.
   3. Aprire la provetta 1 con acqua distillata sterile, e flambarne l'imboccatura portando la provetta fuori dalla cappa solo per il tempo strettamente necessario ad avvicinarla al becco Bunsen, riportandola poi subito sotto cappa.
   4. Versare nella provetta 1 il latte crudo prelevato.
   5. Depositare la pipetta usata in un becher.
   6. Flambare l'imboccatura della provetta 1 e richiuderla.
   7. Agitare la provetta 1.
   8. Aprire la provetta 1 e flambarne l'imboccatura.
   9. Con una nuova pipetta sterile, prelevare 1 mL di soluzione dalla provetta 1.
   10. Flambare l'imboccatura della provetta 1 e richiuderla.
   11. Aprire la provetta 2 e flambarne l'imboccatura
   12. Versare nella provetta 2 la soluzione prelevata dalla pipetta.
   13. Depositare la pipetta usata in un becher.
   14. Flambare l'imboccatura della provetta 2 e richiuderla.
   15. Agitare la provetta 2.
   16. Aprire la provetta 2 e flambarne l'imboccatura.
   17. Con una nuova pipetta sterile, prelevare 1 mL di soluzione dalla provetta 2.
   18. Flambare l'imboccatura della provetta 2 e richiuderla.
   19. Sollevare il coperchio della piastra “Latte crudo 10^-2 piastra 1” e versarvi la soluzione prelevata, richiudere poi il coperchio.
   20. Aprire la provetta 2 e flambarne l'imboccatura.
   21. Con la stessa pipetta, prelevare 1 mL di soluzione dalla provetta 2.
   22. Flambare l'imboccatura della provetta 2 e richiuderla.
   23. Sollevare il coperchio della piastra “Latte crudo 10^-2 piastra 2” e versarvi la soluzione prelevata, richiudere poi il coperchio.
   24. Aprire la provetta 2 e flambarne l'imboccatura.
   25. Con la stessa pipetta, prelevare 1 mL di soluzione dalla provetta 2.
   26. Flambare l'imboccatura della provetta 2 e richiuderla.
   27. Ripetere i passaggi da 11 a 26 con la provetta 3 e le piastre 10^-3.
   28. Ripetere i passaggi da 11 a 23 con la provetta 4 e le piastre 10^-4, depositando alla fine la pipetta usata nel becher.
   29. Ripetere i passaggi da 2 a 28 con il latte pastorizzato.
   30. Aprire il flacone contenente il terreno e flambarne l'imboccatura.
   31. Sollevare il coperchio di una piastra e versarvi il terreno, fino a riempire circa ¾ della superficie della piastra.
   32. Richiudere il coperchio della piastra e mescolare facendo scivolare delicatamente la piastra a otto in orizzontale sul piano di lavoro.
   33. Socchiudere il coperchio della piastra.
   34. Ripetere i punti da 31 a 33 per tutte le piastre, compresa la piastra di controllo terreno, avendo cura di non passare al di sopra delle piastre socchiuse mentre si lavora.
   35. Lasciare raffreddare le piastre.
   36. Una volta che la condensa è sparita, richiudere le piastre.
   37. Incubare le piastre capovolte in termostato a 30 °C per 3 giorni.
4. Lettura delle piastre
   1. Per ciascuna piastra, contare il numero di colonie, segnando sul fondo della piastra, con un pennarello a punta fine, le colonie già contate per evitare conteggi doppi. Scartare i valori minori di 30 o maggiori di 300 (incontabili).
   2. Moltiplicare il numero di colonie per il fattore di diluizione di ciascuna piastra, in modo da ottenere il numero di CFU/mL nel latte tal quale.
   3. Fare una media tra tutte le piastre contabili, e confrontare i valori del latte crudo con quelli del latte pastorizzato.
   4. Sterilizzare le piastre in un sacchetto da autoclave a 121 °C per 15'.

Risultato:

Dopo tre giorni, nelle piastre dove era stato seminato il latte dovrebbero essere cresciute delle colonie visibili ad occhio nudo, mentre la piastra di controllo dovrebbe essere rimasta vuota. Il latte crudo dovrebbe presentare una carica batterica inferiore a 100000 UFC/mL, mentre il latte pastorizzato dovrebbe avere una carica batterica molto inferiore a quella del latte crudo (le piastre del latte pastorizzato potrebbero risultare tutte incontabili per un numero troppo basso di colonie).