Concentrazione minima inibente

Durata:

1 ora (preparazione del terreno) + 1 ora (sterilizzazione) + 2 ore (diluizione antibiotico e semina) + 2 giorni (incubazione) + ½ ora (osservazione piastre)

Inoltre, deve essere già pronta la brodocoltura (3 ore di preparazione + 2 giorni di incubazione)

Scopo:

Individuare la concentrazione minima di antibiotico necessaria a inibire la crescita di un ceppo batterico.

Teoria:

L'amoxicillina è un antibiotico del gruppo delle penicilline, che bloccano la sintesi del peptidoglicano, impedendo la produzione della parete cellulare delle cellule batteriche. L'acido clavulanico va a bloccare le beta-lattamasi, enzimi prodotti da alcuni batteri che neutralizzerebbero l'amoxicillina.

Materiale:

• Brodocoltura di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus termophilus (ottenuti dallo yogurt)
  
• Antibiotico (Amoxicillina + Acido Clavulanico)
  
• Terreno di coltura (MRS Agar), sterilizzato e liquido (>40 °C)
  

Strumenti:

• 6 piastre Petri, sterili
  
• 1 beuta con 100 mL di acqua distillata, sterile
  
• 3 provette con 9 mL di acqua distillata, sterile
  
• 4 pipette graduate, sterili
  
• mortaio e pestello
  
• vetrino da orologio
  
• spatola
  
• bilancia tecnica
  
• becco Bunsen
  

Procedimento:

1. Etichettare le piastre in questo modo:
   

• C.T. (controllo terreno)
  
• senza antibiotico
  
• 1 - 100 mg/L
  
• 2 - 10 mg/L
  
• 3 - 1 mg/L
  
• 4 - 0,1 mg/L
  

2. Numerare la beuta (1) e le provette (2, 3, 4)
   
3. Pesatura dell'antibiotico
   
   1. Pesare una pastiglia di antibiotico
      
   2. Calcolare la massa di pastiglia che contiene 0,1 g di antibiotico:
      
   3. Triturare la pastiglia nel mortaio
      
   4. Pesare sul vetrino da orologio la massa appena calcolata
      
4. Accendere il Bunsen: da questo punto in poi, tutto il procedimento verrà svolto sterilmente vicino alla fiamma
   
   
5. Preparazione delle diluizioni di antibiotico
   
   1. Aprire la beuta, tenendo in mano il tappo di cotone, versarvi dentro l'antibiotico pesato sul vetrino da orologio, e richiuderla
      
   2. Agitare la beuta 1
      
   3. Aprire la confezione di una pipetta sterile.
      
   4. Aprire la beuta 1, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta sterile e richiudere la beuta.
      
   5. Aprire la piastra 1, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la piastra.
      
   6. Aprire la beuta 1, prelevare 1 mL di soluzione con la stessa pipetta e richiudere la beuta.
      
   7. Aprire la provetta 2, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la provetta.
      
   8. Agitare la provetta 2, mettere da parte la pipetta.
      
   9. Aprire la confezione di una nuova pipetta sterile.
      
   10. Aprire la provetta 2, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta sterile e richiudere la provetta.
       
   11. Aprire la piastra 2, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la piastra.
       
   12. Aprire la provetta 2, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta e richiudere la provetta.
       
   13. Aprire la provetta 3, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la provetta.
       
   14. Agitare la provetta 3, mettere da parte la pipetta.
       
   15. Aprire la confezione di una nuova pipetta sterile.
       
   16. Aprire la provetta 3, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta sterile e richiudere la provetta.
       
   17. Aprire la piastra 3, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la piastra.
       
   18. Aprire la provetta 3, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta e richiudere la provetta.
       
   19. Aprire la provetta 4, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la provetta.
       
   20. Agitare la provetta 4, mettere da parte la pipetta.
       
   21. Aprire la confezione di una nuova pipetta sterile.
       
   22. Aprire la provetta 4, prelevare 1 mL di soluzione con la pipetta sterile e richiudere la provetta.
       
   23. Aprire la piastra 4, versarvi il contenuto della pipetta, richiudere la piastra.
       
6. Semina della coltura
   
   1. Aprire la confezione di una nuova pipetta sterile
      
   2. Agitare la provetta con la coltura batterica
      
   3. Tenendola con la mano sinistra, aprire il tappo della provetta con la coltura batterica e flambarne l'imboccatura.
      
   4. Prelevare 1 mL di coltura con la pipetta.
      
   5. Flambare l'imboccatura della provetta e richiuderla
      
   6. Versare 0,5 mL in due piastre, facendo attenzione a non toccare la goccia di soluzione di antibiotico
      
   7. Ripetere i punti da 2 a 6 in modo da inoculare tutte le piastre tranne la piastra CT
      
7. Primo strato di terreno
   
   1. Aprire il contenitore del terreno, e flambarne l'imboccatura
      
   2. Scostare il coperchio di una piastra
      
   3. Versarvi il terreno, in modo che ne copra circa 3/4
      
   4. Richiudere la piastra e muoverla sul bancone con un movimento a 8 in modo che il terreno si sparga su tutta la piastra e si mescoli con la coltura e con l'antibiotico.
      
   5. Spostare la piastra vicino al Bunsen, scostare il coperchio.
      
   6. Ripetere i punti da 2 a 5 per tutte le piastre.
      
   7. Flambare l'imboccatura del contenitore e richiuderlo.
      
8. Secondo strato di terreno
   
   1. Quando il primo strato si sarà solidificato, ripetere la procedura utilizzata per creare un secondo strato di terreno.
      
   2. Lasciar raffreddare le piastre semiaperte vicino al Bunsen
      
9. Incubare a 41° C per 2 giorni, con un becher pieno d'acqua per prevenire l'essiccamento delle piastre.
   
10. Osservare in quali piastre è avvenuta una crescita batterica
    

Risultato:

Le piastre dovrebbero presentarsi così:

Piastra	Crescita
1	Nessuna (piastra trasparente)
2	Nessuna (piastra trasparente)
3	Scarsa (osservabile allo stereomicroscopio)
4	Buona (piastra opaca)
Senza antibiotico	Buona (piastra opaca)
Controllo terreno	Nessuna (piastra trasparente)

Commenti:

Utilizzare un'abbondante quantità di terreno per evitare l'essiccamento. Si potrebbe provare l'esperienza con un batterio aerobio come Escherichia coli.