Colorazione di Gram

Durata: 1 ora

Scopo:

Distinguere i batteri Gram + dai batteri Gram -

Teoria:

I batteri possono avere due diversi tipi di parete cellulare, con una minore o maggiore quantità di peptidoglicano. Il primo colorante (cristalvioletto) entra nelle cellule con entrambi i tipi di parete, ma solo quelle con la parete ad alto contenuto di peptidoglicano lo trattengono, al momento del lavaggio con la soluzione decolorante, risultando quindi colorate di viola. I batteri con la parete a minor contenuto di peptidoglicano, invece, perdono il primo colorante, così che risultano colorati solo dal colorante di contrasto (safranina, rosso/rosa).

Materiale:

• Piastra contenente la colonia da osservare
  
• Soluzione fisiologica
  
• Kit per la colorazione di Gram (Cristalvioletto, Lugol, soluzione decolorante, safranina)
  
• Acqua per lavaggi
  

Strumenti:

• Vetrino portaoggetti
  
• Pinza di legno per vetrini
  
• Ansa
  
• Becco Bunsen
  

Procedimento:

1. Prelievo del campione (lavorare vicino alla fiamma o sotto cappa a flusso laminare)
   
   1. Depositare una goccia di soluzione fisiologica sul vetrino portaoggetti
      
   2. Sistemare la piastra capovolta vicino alla fiamma
      
   3. Sterilizzare l'ansa, lasciarla raffreddare 15''
      
   4. Sollevare il fondo della piastra, prelevare con l'ansa una piccola parte di colonia, e richiudere la piastra
      
   5. Stemperare con l'ansa il campione prelevato nella goccia di soluzione fisiologica sul vetrino
      
   6. Sterilizzare l'ansa
      
2. Fissazione del vetrino
   
   1. Lasciar asciugare il vetrino tenendolo relativamente vicino alla fiamma, ma senza scottarlo (una mano, alla stessa distanza, non deve scottarsi)
      
   2. Tagliare tre volte la fiamma col vetrino, tenendo il lato con i microrganismi verso l'alto
      
3. Colorazione
   
   1. Coprire il campione con una goccia di cristalvioletto, attendere 1'
      
   2. Lavare delicatamente con poca acqua
      
   3. Coprire il campione con una goccia di soluzione di Lugol, attendere 1'
      
   4. Lavare delicatamente con poca acqua
      
   5. Versare goccia a goccia la soluzione decolorante, finché il campione non rilascia più colore
      
   6. Lavare delicatamente con poca acqua
      
   7. Coprire il campione con una goccia di safranina, attendere 1'
      
   8. Lavare delicatamente con poca acqua
      
   9. Asciugare all'aria o alla fiamma
      
4. Osservare al microscopio
   

Risultato:

I batteri Gram + dovrebbero risultare blu/violetti, mentre quelli Gram – dovrebbero risultare rosso/rosa.

Commenti:

La colorazione di Gram è di difficile riuscita, occorre eseguirla con cura e fare diverse prove.

Esempi di microrganismi Gram +: Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus (anche i lieviti risultano Gram +, pur avendo una parete cellulare differente)
Esempi di microrganismi Gram -: Escherichia coli (usare solo ceppi selezionati non patogeni), Acetobacter aceti.