Coltivare i batteri dello yogurt


Lo yogurt è ottenuto dalla fermentazione del latte operata da alcuni batteri, chiamati per questo fermenti lattici. Questi rimangono vivi nello yogurt, e possono entrare a far parte della flora batterica intestinale, diventando così simbionti del nostro organismo.
Lo scopo di questa esperienza è di coltivare i fermenti lattici, e osservare la coltura ottenuta.


Durata: 30' preparazione del terreno, 1 h sterilizzazione, 15' semina, 2 giorni incubazione, 1 h osservazione

Scopo:

Coltivare i fermenti lattici presenti nello yogurt

Teoria:

Lo yogurt scelto come campione contiene due specie di batteri:
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Orla-Jensen 1919) Weiss et al. 1984
    E' un bacillo (batterio a forma di bastoncello, lungo e sottile) immobile e anaerobio (vive in assenza di ossigeno). La sua temperatura di crescita ideale è intorno ai 37° C ed è acidofilo, cioè preferisce ambienti acidi (pH 4,6 – 5,4)
  • Streptococcus thermophilus (ex Orla-Jensen 1919) Schleifer et al. 1995
    E' uno streptococco (batterio di forma sferica che forma corte catenelle) immobile e anaerobio aerotollerante (può vivere sia in presenza che in assenza di ossigeno). La sua temperatura di crescita ideale è tra i 37° e i 45°C.
Entrambi questi batteri ricavano l'energia necessaria per vivere non dalla respirazione, ma dalla fermentazione del lattosio (trasformano il lattosio in acido lattico e anidride carbonica). Facendo questo rendono lo yogurt acido, provocando la coagulazione delle proteine del latte (che rendono così lo yogurt denso) e evitando la crescita di microrganismi indesiderati.
Per coltivare i fermenti lattici si utilizza un terreno di coltura, cioè un substrato nel quale i batteri possano crescere, che contenga tutte le sostanze necessarie alla loro crescita. Per evitare che nel terreno crescano microrganismi indesiderati provenienti dall'ambiente, è necessario lavorare in condizioni di sterilità.

Preparazione del terreno

Materiale:

  • MRS in polvere 0,81 g x provetta (54,3 g / L)
  • Tween 80 circa 1 goccia per provetta (1 mL / L)
  • Acqua distillata 15 mL x provetta
  • Cartina universale

Strumenti:

  • Provette da microbiologia con tappo
  • Cilindro graduato
  • Becher
  • Vetrino da orologio
  • Bacchetta di vetro
  • Spatola
  • Bilancia tecnica
  • Autoclave

Procedimento:

  1. Pesare l'MRS sulla bilancia nel vetrino a orologio
  2. Versarlo nel becher
  3. Versare nel becher l'acqua distillata, misurata col cilindro, lavando il vetrino da orologio
  4. Aggiungere il Tween 80
  5. Mescolare fino a completa dissoluzione
  6. Controllare che il pH sia 6,2-6,5 (se necessario correggere con HCl o NaOH 0,1 M)
  7. Versare nelle provette
  8. Chiudere i tappi
  9. Sterilizzare in autoclave a 121° C per 15'

Semina e incubazione

Materiale:

  • Yogurt
  • Provette col terreno sterile

Strumenti:

  • Ansa
  • Becco Bunsen
  • Cappa a flusso laminare
  • Termostato

Procedimento:

  1. Accendere il Bunsen (accanto alla cappa, ma non dentro)
  2. Sterilizzare l'ansa nella fiamma del Bunsen, e lasciarla raffreddare per almeno 15'' sotto cappa tenendola sempre in mano
  3. Con l'altra mano aprire lo yogurt, e flambarne l'imboccatura (se il vasetto lo consente)
  4. Prelevare con l'ansa una piccola quantità di yogurt
  5. Prendere una provetta di terreno sterile, vicino al tappo, tra il pollice, l'anulare e i mignolo della mano sinistra
  6. Con l'indice e il medio togliere il tappo (tenendolo tra le due dita) e flambare l'imboccatura
  7. Immergere l'ansa nel terreno e agitare, togliere l'ansa
  8. Flambare l'imboccatura della provetta, richiuderla e appoggiarla nel portaprovette
  9. Sterilizzare l'ansa nella fiamma
  10. Etichettare la provetta scrivendo cognome, classe, contenuto, data e temperatura di incubazione
  11. Incubare a 41° C per 2 giorni, insieme ad una provetta di terreno non inoculata (controllo terreno)

Osservazione

Materiale:

  • Provette incubate
  • Soluzione fisiologica
  • Olio da immersione

Strumenti:

  • Vetrino portaoggetti
  • Vetrino coprioggetto
  • Ansa
  • Becco Bunsen
  • Cappa a flusso laminare
  • Microscopio

Procedimento:

  1. Accendere il Bunsen (accanto alla cappa, ma non dentro)
  2. Depositare una goccia di soluzione fisiologica sul vetrino portaoggetti
  3. Sterilizzare l'ansa nella fiamma del Bunsen, e lasciarla raffreddare per almeno 15'' sotto cappa tenendola sempre in mano
  4. Prendere una provetta, vicino al tappo, tra il pollice, l'anulare e i mignolo della mano sinistra
  5. Agitare la provetta a lungo in modo da sospendere l'eventuale sedimento
  6. Con l'indice e il medio togliere il tappo (tenendolo tra le due dita) e flambare l'imboccatura
  7. Immergere l'ansa nel terreno e agitare, togliere l'ansa
  8. Flambare l'imboccatura della provetta, richiuderla e appoggiarla nel portaprovette
  9. Stemperare l'ansa nella goccia di soluzione fisiologica sul vetrino portaoggetti
  10. Sterilizzare l'ansa nella fiamma
  11. Coprire la goccia col vetrino coprioggetti
  12. Osservare al microscopio

Risultato:

Le provette inoculate con yogurt dopo l'incubazione dovrebbero presentarsi torbide con molto sedimento, mentre la provetta di controllo dovrebbe rimanere limpida.
Al microscopio dovrebbero vedersi, agli obiettivi 40x e 100x, batteri a forma di bastoncelli e catene di cocchi.
Lactobacillus, colorazione di Gram

Streptococcus, colorazione di Gram

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