Questa tecnica viene generalmente usata per separare tra loro frammenti di DNA di dimensioni diverse (come nel caso del DNA fingerprinting nelle scienze forensi), ma può anche essere usata per evidenziare la presenza di DNA genomico in un campione.
Qui viene descritta per sommi capi la tecnica usata nel nostro laboratorio, attraverso il kit per elettroforesi EDVOTEK, per il procedimento dettagliato si rimanda al manuale di istruzioni del kit.
Durata:
1 ora preparazione, 1 o 2 ore elettroforesi, un giorno per la colorazione
Scopo:
Evidenziare la presenza di DNA genomico in un campione, o separare tra loro frammenti di DNA di diversa lunghezza.
Teoria:
Il DNA, a pH leggermente basico, presenta cariche negative sui suoi gruppi fosfato: quindi, se è immerso in un campo elettrico, subisce una forza che lo attira verso il polo positivo. Se però si trova in un mezzo che ne ostacola il movimento, come ad esempio un gel, subirà anche una forza che si oppone al suo movimento, e che dipende sia dalle caratteristiche del mezzo in cui si muove, sia dalle dimensioni della molecola di DNA. Come risultato di queste due forze, le molecole più piccole si sposteranno più rapidamente attraverso il mezzo, mentre le molecole più grandi si sposteranno più lentamente.
Su questo principio si basa l'elettroforesi: applicando un campo elettrico ad un gel nel quale è posta una miscela di molecole cariche di dimensioni diverse, queste si spostano nel gel con velocità diverse a seconda della loro dimensione, quindi dopo un certo tempo si saranno separate, e si troveranno in posizioni diverse del gel a seconda della loro dimensione.
Materiale:
- Gel di agarosio 0,8 % con tampone Tris HCl e EDTA a pH 7,6, con pozzetti per il caricamento dei campioni
- Soluzione tampone Tris HCl e EDTA a pH 7,6
- Campioni di DNA sciolti nel tampone per il caricamento su gel (Tris HCl, EDTA, glicerolo e colorante, a pH 7,6)
- Blu di metilene
Strumenti:
- Camera di elettroforesi e alimentatore
- Micropipetta da 20 - 200 uL e relativi puntali
- Vaschetta in grado di contenere la lastrina di gel
- Cilindro graduato
Procedimento:
- Preparare la camera di elettroforesi con la lastrina di gel e la soluzione tampone, come da istruzioni del produttore
- Con la micropipetta, prelevare 45 uL di ogni campione e, con cautela, versali ciascuno in un pozzetto del gel, usando ogni volta un puntale nuovo.
- Accendere l'alimentatore a 150 V e attendere circa 20'.
- Spegnere l'alimentatore e trasferire con cautela la lastrina di gel in una nuova vaschetta.
- Aggiungere 75 mL di soluzione tampone.
- Aggiungere il colorante blu di metilene (in caso si usino card di colorante, depositare la card nella soluzione in modo che sia immersa, col colorante verso il basso).
- Attendere circa 24 ore, eliminare il colorante e osservare il risultato.
Risultato:
Al termine della colorazione dovrebbero essere evidenti, sulla lastrina, le bande di DNA: quelle più vicine ai pozzetti sono quelle relative alle molecole più grandi, quelle più lontane viceversa sono relative ai frammenti di minori dimensioni. Se è presente DNA genomico non frammentato, cioè cromosomi interi, questi dovrebbero formare una banda evidente molto vicina ai pozzetti.
Durante l'elettroforesi agli elettrodi si sviluppano bollicine (idrogeno e ossigeno), e il colorante blu presente nei campioni di DNA si vede migrare lungo la lastrina di gel.
Consigli di sicurezza:
Le sostanze usate non sono particolarmente pericolose, è comunque buona norma usare guanti soprattutto nella fase di colorazione.
Occorre fare attenzione nel momento dell'elettroforesi, perché gli elettrodi vengono alimentati con una grande differenza di potenziale (150 V).
Commenti:
Il caricamento del gel con la micropipetta è una fase delicatissima ed è molto facile sbagliare, conviene fare prima delle prove con la soluzione di prova.
Bibliografia:
- EDVOTEK Inc., 2009, PCR Amplification of DNA for fingerprinting.
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