Estrazione del DNA da cellule animali

"Meduse" di DNA a partire da quantità diverse di fegato

Avete presente la classica esperienza di estrazione del DNA dalla banana, fatta un po' in tutte le scuole del mondo, in cui con un po' di sale e di detersivo si estrae una massa gelatinosa che l'insegnante sostiene essere DNA? Bene, sappiate che è un falso. O almeno, quella massa gelatinosa non è fatta da DNA genomico integro. Lo si può dimostrare facendone l'elettroforesi su gel di agarosio: non si vede nessuna banda a lenta corsa caratteristica delle grandi molecole di DNA genomico, che, quindi, non è presente in quantità apprezzabili. Il motivo, probabilmente, sta nel fatto che nel procedimento normalmente seguito non c'è nessun passaggio in grado di rompere le pareti cellulari.

Vi proponiamo qui, invece, una procedura di estrazione del DNA da cellule animali, adattata da procedure normalmente utilizzate in laboratori di ricerca, il cui risultato è stato verificato tramite elettroforesi su gel di agarosio.

Durata: 1 o 2 ore

Scopo:

Estrarre il DNA da cellule animali.

Teoria:

Per estrarre il DNA da cellule animali occorre prima rompere le membrane cellulari e nucleari, dopodiché separarlo dalle altre sostanze contenute nella cellula, principalmente proteine, carboidrati e lipidi.

Le membrane, costituite da fosfolipidi, possono essere rotte usando un tensioattivo, come quelli contenuti in un detersivo per piatti. Si ottiene così un'emulsione di tutti i componenti cellulari, oltre che delle molecole di tensioattivo.

A questo punto, aggiungendo una soluzione satura di cloruro di sodio, si aumenta la concentrazione salina della soluzione rompendo l'emulsione e facendo precipitare tutte le sostanze non particolarmente idrosolubili: proteine, lipidi e buona parte del tensioattivo escono dalla soluzione e passano in fase solida, mentre carboidrati, acidi nucleici e sali, che sono sostanze particolarmente solubili in acqua, rimangono in soluzione. E' quindi possibile, dopo centrifugazione, separare la fase liquida, contenente il DNA, dalla fase solida, contenente sostanze che non interessano alla nostra analisi.
Per isolare il DNA da sali e carboidrati si può sfruttare la sua scarsa solubilità in alcool: aggiungendo etanolo alla soluzione si diminuisce la polarità del solvente, e il DNA passa in fase solida. A questo punto è possibile centrifugare ed eliminare la parte liquida, contenente sali e carboidrati, ottenendo una fase solida costituita principalmente da DNA.

Materiale:

• Fegato di pollo
• TKM buffer:
• Tris HCl 10 mM, regolato a pH 7,6
• KCl 10 mM
• MgCl₂ 50 mM
• EDTA 2 mM
• NaCl 80 mM
• Detersivo per piatti
• NaCl soluzione satura
• Etanolo assoluto (oppure etanolo al 95%)

Se si prosegue fino alla ridissoluzione del DNA occorre anche:

• Etanolo 70%
• TE buffer:
• Tris HCl 10 mM, regolato a pH 8,0
• EDTA 1 mM

Strumenti:

• Tagliere
• Coltello
• Pinzetta
• Spatola
• Vetrino da orologio
• Provette da centrifuga, tappi e portaprovette
• Pipette graduate e propipette
• Pipette Pasteur
• Bagno termostatico
• Centrifuga
• Bilancia tecnica

Procedimento:

1. Etichettare due provette da centrifuga con il nome del gruppo e i numeri 1 e 2 rispettivamente.
2. Tritare un pezzo di fegato fino a ridurlo in poltiglia.
3. Pesare su un vetrino da orologio circa 0,5 g di fegato. Annotare il peso.
4. Trasferirli nella provetta 1.
5. Aggiungere 3 mL di TKM buffer.
6. Aggiungere 0,5 mL di detersivo per piatti.
7. Tappare la provetta con il tappo e agitare.
8. Lasciare in bagnomaria a 37° C per 5'.
9. Aggiungere 1 mL di soluzione satura in NaCl.
10. Centrifugare a 4000 rpm per 10', senza tappo.
11. Con una pipetta Pasteur, trasferire la fase liquida nella provetta 2, avendo cura di trasferire soltanto il liquido e non muovere la fase solida. E' meglio trasferire solo parte del liquido che trasferire anche parte del solido.
12. Scartare la provetta 1 e continuare l'analisi sulla provetta 2.
13. Aggiungere 3 mL di etanolo assoluto.

Se si vuole procedere fino alla ridissoluzione del DNA:

1. Tappare la provetta con il tappo e agitare dolcemente. 
2. Centrifugare a 4000 rpm per 10', senza tappo. 
3. Con una pipetta Pasteur, eliminare la fase liquida, avendo cura di non rimuovere la fase solida. 
4. Aggiungere 3 mL di etanolo al 70%. 
5. Tappare la provetta con il tappo e agitare dolcemente. 
6. Centrifugare a 4000 rpm per 10', senza tappo. 
7. Con una pipetta Pasteur, eliminare la fase liquida, avendo cura di non rimuovere la fase solida.
8. Lasciar asciugare la fase solida.
9. Aggiungere 1 mL di TE buffer. 
10. Tappare la provetta con il tappo e agitare dolcemente, fino a completa solubilizzazione del solido.

Risultato:

Una volta aggiunto l'etanolo assoluto, dovrebbe formarsi un evidente "gomitolo" di DNA in sospensione. Se si prosegue fino alla ridissoluzione del DNA, si ottiene una soluzione che può essere conservata in frigorifero per alcuni giorni e utilizzata per altri esperimenti.

Consigli di sicurezza:

Alcune delle sostanze usate per preparare i tamponi TKM e TE possono essere pericolose, ma i tamponi sono estremamente diluiti e non presentano rischi significativi. E' comunque buona norma lavorare con i guanti.

Bibliografia:

• Lahiri, D. K., & Nurnberger Jr, J. I. (1991). A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucleic acids research, 19(19), 5444.
• Lahiri, D. K., Bye, S., Nurnberger, J. I., Hodes, M. E., & Crisp, M. (1992). A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. Journal of biochemical and biophysical methods, 25(4), 193-205.
• Lahiri, D. K., & Schnabel, B. (1993). DNA isolation by a rapid method from human blood samples: effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Biochemical genetics, 31(7-8), 321-328.
• Miller S. A., Dykes D. D., Polesky H. F.. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acid research 16 (3), 1988, p. 1215.

Si ringrazia il Prof. Mauro Mandrioli per le critiche al procedimento "classico" e le indicazioni di possibili protocolli di estrazione.